2023年4月7日，浙江大学逯慧杰老师课题组应用长光辰英核心产品——P300共聚焦拉曼光谱仪和S3000超快三维荧光成像系统在《ACS ES&T Water》期刊上发表了题为“Phosphorus Removal and Storage Polymer Synthesis by Tetrasphaera-Related Bacteria with Different Carbon Sources”的论文。本研究整合了共聚焦拉曼光谱和荧光原位杂交技术来理解Tetrasphaera-PAO的代谢差异。

一、研究背景

在废水的处理中，生物除磷比化学除磷更具成本效益和可持续性。聚磷菌(PAO)在富碳厌氧(FEAST)条件下使用聚磷酸盐(Poly-P)作为能源，将碳源转化为生物大分子，如聚羟基烷酸酯(PHA)。在随后的缺碳好氧(饥荒)条件下，磷酸盐以多聚形式积累。有机碳源是影响磷释放和吸收活性的关键因素。Tetrasphaera能够利用葡萄糖和氨基酸作为碳源。这些化合物提供了吸收磷所需的90%的能量，乙酸盐、葡萄糖和甘油是强化废水反硝化的常用碳源，并对其除磷动力学和化学计量进行了比较。利用上述碳源，还没有揭示Tetrasphaera-PAO的碳磷代谢特性。这项研究的总体目标是揭示与Tetrasphaera相关的PAO的代谢多样性以及不同碳源对其C和P代谢的调节。具体目标是：(1)确定在复合有机物(酪蛋白氢裂解物)补给的除磷生物反应器中Tetrasphaera-PAO的系统发育和代谢潜力；(2)揭示不同碳源(即乙酸盐、葡萄糖和甘油)的Tetrasphaera-PAO的C和P代谢特征；以及(3)建立不同碳源下Tetrasphaera-PAO的代谢和能量模型。利用荧光原位杂交技术(FISH)结合和拉曼光谱对Tetrasphaera-PAO中的多聚P、糖原和PHA等细胞内储存化合物进行了原位定量。预期结果将为深入了解Tetrasphaera-PAO的碳来源依赖的代谢及其对全球废水除磷的贡献提供洞察。

二、研究内容

在本研究中，我们确定了一个新的分支，Tetrasphaera为主要的聚磷菌在实验室规模的除磷反应器中富集。Tetrasphaera-PAOs在乙酸盐下的释磷和吸磷效率均高于甘油和葡萄糖。甘油和葡萄糖发酵提供的能量分别是多聚磷水解法的4倍和1.7倍，两者之间的权衡导致磷的释放较差。拉曼荧光原位杂交结果表明，聚羟基烷酸酯(PHA)是由乙酸酯合成的。另一方面，糖原是甘油和葡萄糖形成的关键储能化合物。乙酸乙酯的好氧磷吸收效率分别是甘油和葡萄糖的4.4倍和1.8倍，这是因为PHA的水解提供了额外的能量。Tetrasphaera-PAO的代谢多样性和发酵能力支持它们在EBPR中的流行，并强调了它们与群落中其他种群潜在的代谢相互作用。这项工作加深了我们对Tetrasphaera-PAO遗传和代谢差异的理解，为在不同的碳源条件下优化废水除磷提供了有用的信息。

图1.流程图

由图2的研究结果，可以看出PAO包括C. accumulibacter(从4.97%到168天的0)和Microlunatus phosphovorus(168天<0.2%)，被Tetrasphaera-PAOs 击败并在实验操作中被淘汰(图2和图3)。这可能是因为这些种群更喜欢使用小分子有机物，如乙酸盐。Candidatus competibacter，典型的GAOs，从0.03%增加到1.71%，可以与Tetrasphaera-PAO竞争氨基酸。

图2. (A)SBR群落中PAO和GAO种群的动态。数字和气泡大小代表基于元基因组学的相对丰度(%)。(B)第168天SBR污泥的FISH图像。Tetrasphaera-PAO以红色显示，Eubacteria以绿色显示

图3.污泥的复合FISH图像， Ca. Accumulibacter 呈红色和Eubacteria呈绿色

图4. Tetrasphaera-PAOS与乙酸盐、甘油、葡萄糖和利用的代谢模型

上述图4结果表明分支1?3编码两条乙酰辅酶A合成途径，分别涉及ACs和Ack-PTA，而分支4缺少ackA，因此可能仅使用ACs途径(比Ack-Pta途径消耗更多的ATP)。大多数Tetrasphaera-PAO(6/9 MAGs)缺乏甘油运输复合蛋白，导致甘油吸收的效率较低。在葡萄糖利用方面，分支1?3可以从葡萄糖合成糖原或通过糖酵解(通过传统的Embden?Meyerhof?Parna，或emp途径)将葡萄糖转化为丙酮酸、酮戊二酸和草酰乙酸酯，其中所有相关基因都是完整的。分支4 包含完整的糖原合成途径，但缺少编码6-磷酸果糖激酶的pfk1，从而催化EMP途径中从6-磷酸果糖到1,6二磷酸果糖的速率限制步骤。另一种选择是，分支4可能使用Entner?Doudoroff途径进行糖酵解，该途径比EMP途径更短，但产生的ATP更少。

图5. 不同碳源培养的Tetrasphaera-PAOS细胞内多聚磷、PHA和糖原含量

Tetrasphaera-PAO的胞内多聚P、PHA和糖原作为P和C的储存化合物因使用的碳源而不同(图5)。在厌氧?好氧转化过程中，乙酸盐的释放和吸收是最有效的，导致胞内多聚磷的含量发生了剧烈的变化(相差2.75倍)。葡萄糖和甘油、PolyP变异相似(分别相差1.75倍和1.45倍)。另一方面，厌氧PHA只对乙酸酯有积累，而对葡萄糖和甘油没有。然后在好氧阶段消耗一小部分PHA(从7.39×10?13降至6.92×10?13 g C/cell)。甘油和葡萄糖的糖原积累和降解规律相似。然而，当加入乙酸盐时，糖原在厌氧阶段迅速消耗能量，在好氧阶段持续减少。值得注意的是，拉曼FISH能够原位量化目标细胞中的聚合物含量，而不是群落其他成员。此技术的准确性可以通过细胞分选和单细胞测序技术进行验证。上述结果证实了分支4 Tetrasphaera-PAOs具有从乙酸盐合成PHA的潜力，不同于以前的研究表明大多数Tetrasphaera不能合成PHA。

图6. 不同碳源对贮藏化合物合成和水解酶关键基因表达水平的影响

为了进一步验证所构建的 Tetrasphaera-PAO吸收不同碳源的代谢模型(图4)，用Tetrasphaera-PAO的特异引物通过RT-qPCR定量测定了参与合成和储存化合物水解的关键基因的表达水平(图6)。这一结果与观察到的三种碳源的糖原积累、多聚磷水解和积累模式是一致的。甘油和葡萄糖在厌氧期的GALU(编码糖原合成酶)的变化比乙酸乙酯高5?7倍。在Tetrasphaera-PAO中，确实有甘油和葡萄糖被转化为糖原作为储能化合物。此外，ppk2(聚P水解酶)对乙酸酯的上调作用最强，对甘油的上调作用最低。ppk(多聚磷合成)在乙酸盐的上调作用最强，在葡萄糖的作用下最低。

三、结论

在本研究中，在实验室规模的除磷反应器中，一株新的与Tetrasphaera相关的发酵细菌被鉴定为主要的聚磷菌。它们在利用碳源方面具有代谢的多功能性，包括但不限于乙酸酯、甘油和葡萄糖，而只有乙酸酯能有效地去除磷，并形成PHA作为储存聚合物。当使用甘油和葡萄糖时，磷的吸收最小，这两种有机物被转化为糖原。甘油和葡萄糖发酵比多聚磷发酵提供更多的能量，但同时可能阻碍磷的释放。在废水EBPR中，发酵对Tetrasphaera聚磷菌的存活甚至优势起着关键作用。这些发现扩大了我们目前对关键但研究较少的PAO组的的理解，将有助于更好地解释它们在废水除磷以及在全球磷生物化学循环中的作用。

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acsestwater.3c00046